طراحی پرایمر، مفاهیم و تعاریف

طراحی پرایمر صحیح برای درست انجام شدن یک واکنش PCR بسیار ضروری است. برای اکثیر یک قطعه با بهره وری بالا رعایت نکاتی ضروری است:

1- طول پرایمر:

به طور معمول، طول 22-18 نوکلئوتید برای یک پرایمر بهینه است. اگر طول پرایمر کمتر باشد، احتمال اتصال غیر اختصاصی بالا می­رود و اگر از این محدوده بیشتر باشد، اتصال پرایمر به الگو در دمای اتصال سخت­تر می­شود.

 

2- دمای ذوب پرایمرها:

دمای ذوب پرایمرها یا به اصطلاح Tm، دمایی است که نیمی از DNA دو رشته­ای از هم جدا می­شود و DNA تک رشته­ای ایجاد می­کند. Tm نشانگر پایداری DNA دورشته­ای است. پرایمرهایی با Tm 58-52 درجه­ی سانتی گراد معمولا بهترین نتایج را به دست می­دهند. Tm متاثر از محتوای GC یک توالی است.

 

3- دمای اتصال پرایمرها:

دمای ذوب پرایمرها تخمینی از میزان پایداری هیبرید DNA-DNA است و در تعیین دمای اتصال خیلی اهمیت دارد. اگر دمای اتصال(Ta) خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو از هم جدا باقی می­مانند و اتصال صورت نمی­گیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد تنها برخی از نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو متصل می­شود و اتصال درستی رخ نمی­دهد و محصولات غیر اختصاصی تولید می­شود. از فرمول Rychlik برای به دست آوردن Ta استفاده می­شود:

Ta= 0.3×Tm(primer)+ 0.7×Tm(product)−14.9

 

4- محتوای GC:

نسبت بازهای GC به کل بازها باید بین 60-40 درصد باشد.

 

5- گیره  GC(GC clamp):

وجود بازهای GC در 5 باز انتهای ‘3 پرایمرها(که به آن گیره GC گفته می­شود) اتصال اختصاصی در انتهای ‘3 را بهبود می­بخشد(به علت اتصال قوی­تر بازهای G و C). در 5 باز انتهایی سمت ‘3 نباید بیش از G3 یا C قرار داشته باشد.

 

6- ساختار ثانویه پرایمر:

حضور ساختارهای ثانویه­ای که تحت تاثیر برهم کنش­های بین مولکولی یا درون مولکولی ایجاد می­شوند، منجر به تولید محصول بسیار ناچیز PCR می­شود و یا اصلا محصولی تولید نمی­شود. وجود این ساختارهای ثانویه برخلاف اتصال پرایمرها به الگو و تکثیر عمل می­کنند. این ساختارها به میزان قابل توجهی دسترسی به پرایمرها را کاهش می­دهند.

 

– ساختارهای سنجاق سری(hairpins):

این ساختارها جزء برهم کنش­های درون مولکولی پرایمرها هستند و باید از آن­ها دوری شود. اگر انتهای ‘3  پرایمر یک ساختار سنجاق سری با ΔG(انرژی آزاد گیبس، هرچه منفی­تر باشد، ساختار پایدارتر است) kcal/mol2- داشته باشد و یا یک ساختار سنجاق سری درونی با ΔG= -3 kcal/mol داشته باشد، معمولا قابل تحمل است و مشکلی ایجاد نمی­کند.

 

– دیمر خودی(self dimer):

دیمر خودی پرایمر ناشی از برهم کنش­های بین مولکول­های پرایمر(از یک جنس) است. معمولا در یک واکنش از مقادیر زیادی از پرایمرها نسبت به میزان الگوی PCR استفاده می­شود. وقتی پرایمرها تمایلشان برای اتصال به خودشان بیشتر از تمایلشان برای اتصال به الگو باشد، محصول PCR کمتری تولید می­شود. معمولا دیمر انتهای ‘3  با ΔG= -5 kcal/mol و دیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.

 

– دیمر متقابل(cross dimer):

دیمرهایی که براساس برهم کنش­های بین مولکولی بین پرایمرهای سنس و آنتی سنس(جلویی و عقبی) به وجود می­آیند. به طور معمول دیمرهای متقابل انتهای ‘3 با ΔG= -5 kcal/mol و دیمرهای متقابل درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.

 

7- تکرارها:

شامل تکرارهای دو نوکلئوتیدی که مدام در یک توالی تکرار می­شوند. حداکثر تعداد تکرارهای قابل قبول، 4 تکرار دو نوکلئوتیدی است.

 

8- Runs:

منظور پرایمرهایی با تکرارهای تک نوکلئوتیدی زیاد، پشت سر هم است که می­تواند باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمر شود. به عنوان مثال AGCGGGGGATGGGG تکرارهای 5 و 4 تایی از G را دارد. حداکثر تعداد تکرار قابل قبول برای یک باز، 4 جفت باز است.

 

9- پایداری انتهای ‘3:

منظور حداکثر میزان ΔG برای 5 باز انتهایی ‘3 است. انتهای ‘3 نا پایدار(با ΔG منفی کمتر) منجر به اتصال­های اشتباه کمتری می­شود.

 

10- از ساختارهای ثانویه الگو دوری کنید:

پرایمرها باید برای ناحیه­ای طراحی شوند که آن ناحیه ساختار ثانویه پایداری تشکیل ندهد. در غیر این صورت این ساختارهای ثانویه­ی پایدار اجازه اتصال پرایمرها به الگو را نمی­دهند.

 

11- از همولوژی متقابل دوری کنید:

برای بالا بردن اختصاصیت پرایمرها باید از نواحی همولوگ دوری کرد. به عبارت ساده­تر، پرایمرها باید به گونه­ای طراحی شوند که نواحی دیگر ژنومی را نشناسند و آن­ها را تکثیر نکنند. با BLAST کردن پرایمرها این ویژگی بررسی می­شود.

 

12- طول قطعه تکثیر شونده:

طول قطعه تکثیر شونده در qPCR نزدیک به 100جفت باز و در PCR استاندارد نزدیک به 500 جفت باز است. اگر جایگاه قرارگیری پرایمرها بر روی الگو را بدانید، طول محصول از فرمول زیر به دست می­آید:

طول محصول= (جایگاه پرایمر جلویی- جایگاه پرایمر عقبی)+1

 

13- دمای ذوب جفت پرایمرها:

یک جفت پرایمر(عقبی و جلویی) باید Tm نزدیک به هم داشته باشند تا بهترین کارایی را داشته باشند. اختلاف 5 درجه سانتی گراد یا بیشتر مانع تکثیر می­شود.

آموزش طراحی گام به گام پرایمر با نرم افزار Gene Runner