آشنایی با نرم افزارهای طراحی پرایمر:

این روزها تنوع نرم افزارهای طراحی پرایمر به قدری زیاد شده که گاهی برای انتخاب یک نرم افزار جامع با مشکل مواجه می­شویم. در راهنمای زیر اطلاعاتی از برخی از این نرم افزارها آورده شده است و یک بار از یک مسیر برای طراحی پرایمر استفاده شده است. این مسیر شامل استفاده از تعدادی از نرم افزارها و وبسایت های مرتبط می­باشد.

GeneRunner:
این نرم افزار را می­توانید به صورت رایگان دانلود کنید. در صفحه اصلی این نرم افزار مطابق شکل 1، گزینه File و سپس Nucleic acid sequence را انتخاب کنید. صفحه ای مشابه شکل 2 باز خواهد شد.

1

شکل 1

2

شکل 2

در این صفحه توالی مورد نظر الگو را باید قرار دهید. برای گرفتن توالی ژن مورد نظر خود می­توانید از پایگاه داده NCBI به آدرس www.ncbi.nlm.nih.gov استفاده کنید. کافی است وارد سایت شوید و نام ژن مورد نظر خود را در بخش جستجو وارد کنید. برای دریافت توالی در قسمت پایگاه داده، Nucleotide  را انتخاب کنید(شکل3).

4

شکل 3

پس از وارد کردن نام ژن مورد نظر و سپس انتخاب گزینه search، صفحه ای مشابه شکل 4 باز می­شود که در آن لیستی از ژن­ها با کلیدواژه­ای که شما جستجو کرده­اید ردیف می­شود. بسته به گونه مورد نظر خودباید از این لیست ژن خود را انتخاب کنید.

3

شکل 4
پس از انتخاب گزینه مورد نظر صفحه ای مشابه شکل 5 باز می­شود که همه اطلاعات مربوط به ژن شما در آن صفحه موجود است. با انتخاب گزینه FASTA در بالا و سمت چپ این صفحه به توالی قطعه مورد نظر خود در قالب FASTA دسترسی پیدا خواهید کرد.

 

5

شکل 5

توالی به دست آمده مشابه شکل 6 را کپی کرده و در صفحه نرم افزار GeneRunner، paste کنید(شکل7).

6

شکل6

 

7

شکل7

این نرم افزار قابلیت دو رشته­ای کردن توالی­ها را دارد. بنابراین شما با کپی کردن توالی یک رشته­ای مورد نظر خود به توالی دو رشته­ای آن دست پیدا می­کنید. همانطور که می­دانید برای انتخاب توالی پرایمر جلوییباید از رشته sense استفاده کرد. به عبارت ساده­تر، ژن مورد نظر شما روی هر رشته­ای باشد از توالی همان رشته در جهت 5′ به سمت 3′ برای پرایمر جلویی باید استفاده کنید و برای پرایمر عقبی هم از توالی رشته مکمل انتخاب کنید. دقت داشته باشید که جهت این پرایمرها حتما از 5′ به سمت 3′ باشد(شکل8).

8

شکل8

با در نظر گرفتن این نکته، به صورت دستی از ابتدای قطعه مورد نظر توالی­های 22-18 نولکئوتیدی را انتخاب کرده و سپس از منوی بالای صفحه GeneRunner، گزینه Analysis و سپس Oligo را انتخاب کنید(شکل9). از میانبر Ctrl-L نیز می­توانید استفاده کنید. بعد از این صفحه­ای برای شما باز می­شود که در آن ویژگی­های مهم قطعه انتخاب شده را مشاهده می­کنید. اطلاعاتی از قبیل درصد GC، پایداری دیمرهای خودی و ساختارهای ثانویه و … در این صفحه ارائه می­شود(شکل10). در مبحث راهنمایی طراحی پرایمر، اکثر ویژگی­های مهم پرایمرها توضیح داده شده­اند.

9

شکل9

یک راه میانبر!

یک راه میانبر برای دست یابی به پرایمرها، استفاده از ابزار primer Blast سایت NCBI است. اگرچه پرایمرهای پیشنهادی این بخش لزوما قابل اطمنیان ترین نیستند و حتی گاهی مشکلات فاحشی دارند، اما راه بسیار سریعی است و اگر خوش شانس باشید شاید بهترین پرایمرها را هم به شما بدهد!

11شکل10


10

شکل 11

برای استفاده از این روش، باید توالی قطعه مورد نظر را داشته باشید. نحوه دست یابی به توالی پیش از این توضیح داده شده است. وارد سایت NCBI شوید و از گزینه­های سمت راست صفحه اصلی، Blast را انتخاب کنید(شکل1-11). بعد از ورود به صفحه Blast، از بخش­های پایین صفحه تحت عنوان specialized searches، گزینه primer blast را انتخاب کنید(شکل2-11).

12شکل12

پس از ورود به صفحه primer blast، در باکس بالای صفحه باید توالی مورد نظر خود را قرار دهید و گزینه get primers در پایین صفحه را انتخاب کنید. اکنون صفحه ای مشابه شکل 12 برای شما باز می­شود که موقعیت و سایر اطلاعات جفت پرایمرهای پیشنهادی را در آن مشاهده می­کنید.

 

 

 

نکته بسیار مهم: پرایمرها را چک کنید!

حتما پرایمرها را قبل از سفارش چک کنید. چه پرایمرها را خودتان با روش اول انتخاب کردید، چه از NCBI به صورت آماده به دست آورده­اید و چه از مقالات توالی را استخراج کرده­اید، حتما در نرم افزارهای دیگر هم چک کنید. هر نرم افزار یا وب سایتی که برای این کار طراحی شده است از الگوریتم­های ویژه خودش استفاده می­کند. وقتی پرایمرها را با چند الگوریتم مختلف بررسی می­کنید در حقیقت اطمینان بیشتری به دست می­آورید. آنچه کیفیت یک پرایمر را بالا می­برد کارایی بالای آن در شناسایی قطعه مورد نظر شماست. حتما بعد از طراحی، پرایمرها را Blast کنید. وارد بخش primer blast سایت NCBI شوید و این بار توالی پرایمر جلویی و عقبی را در باکس­های مربوط به خودشان کپی کنید. بسته به کارتان پایگاه داده مورد نظر را انتخاب کنید و در آخر، گزینه get primers را بزنید. در صورتی که پرایمر شما علاوه بر قطعه خودتان، قطعه­های دیگری را بشناسد، بهتر است پرایمرها را عوض کنید. مگر اینکه قطعه غیر اختصاصی­ای که می­شناسد اختلاف طول فاحشی با قطعه شما داشته باشد. البته برای real-time PCR این مساله جدی تر است و هیچ قطعه دیگری را نباید بشناسند.

طراحی پرایمر، مفاهیم و تعاریف